摘 要： 目的研究氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)在喉鱗癌患者組織中的表達水平及與臨床病理指標的相關性，探討CPS1對喉鱗癌的臨床意義。方法 采用逆轉錄實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)及Western blot免疫印跡技術，分別檢測喉鱗癌組織及癌旁組織中CPS1 mRNA及蛋白表達水平，同時采用免疫組織化學法檢測 CPS1在喉鱗癌組織中的表達水平及其結構中的分布情況。結果 RT-qPCR 和Western blot結果顯示，與癌旁組織相比，喉鱗癌組織CPS1 mRNA 和蛋白表達明顯增高，表達差異有統計學意義（P<0.01）；免疫組化結果顯示CPS1表達與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移等因素密切相關（P<0.05），而與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史及腫瘤部位無關（P>0.05）。結論 在喉鱗癌組織中CPS1的mRNA和蛋白表達明顯升高，且與臨床進展密切相關，說明CPS1在喉癌發生及轉移過程中起到一定的作用，可能作為喉癌診斷的重要指標。
關鍵詞： 氨基甲酰磷酸合成酶1; 喉鱗狀細胞癌; 臨床進展;
Abstract： Objective To study the expression levels of carbamyl phosphate synthase 1 (CPS1) in laryngeal squamous cell carcinoma and reveal its possible correlation with clinical parameters, and explore the clinical significance of CPS1 in the disease. Methods The real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) was used to measure the expression of CPS1 mRNA in laryngeal squamous cell carcinoma and adjacent tissues. Western blotting and immunohistochemistry were used to detect expression levels of CPS1 protein and its distribution in laryngeal squamous cell carcinoma tissues. Result The results of RT-qPCR and Western blot analysis showed that the mRNA and protein expression levels of CPS1 in laryngeal squamous cell carcinoma were significantly higher than that in adjacent tissues(P<0.01).Immunohistochemistry showed the same trend in CPS1 protein level, The expression of CPS1 was closely related to the degree of tumor differentiation, clinical stage, and lymph node metastasis(P<0.05), but not to the patient's age, gender, smoking history, drinking history, and tumor site(P>0.05). Conclusion The expression of CPS1 in laryngeal squamous cell carcinoma is significantly higher than in the adjacent tissues, and is closely related to clinical progress. These results suggest that CPS1 may play a role in the occurrence and metastasis of laryngeal cancer, and is a diagnostic indicator for laryngeal cancer.
Keyword： Carbamyl phosphate synthase 1; Laryngeal squamous cell carcinoma; Clinical progress;
喉癌是頭頸部最常見的腫瘤之一，其中最常見的病理類型是喉鱗狀細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma,LSCC），約占90%以上。其是由遺傳和環境因素相互作用而引起的一種復雜疾病。接觸石棉、灰塵和多環芳烴與喉癌的風險增加有關[1,2,3]。近40年來，喉癌發病率不斷上升，嚴重影響了人們的生活質量。局部浸潤、淋巴結轉移和遠處轉移是喉癌預后不良的主要原因[4]。目前，手術仍是喉癌的主要治療方法[5]。盡管包括外科技術、化療藥物和放射治療在內的治療策略已經取得了進展，但喉癌患者的5年總生存率仍然低至61%[1,6]。它的相關并發癥，如咳嗽、呼吸困難、吞咽困難等，仍然給患者帶來很大的痛苦[7]。目前喉癌的發病機制尚不清楚，因此，闡明喉癌的重要分子發病機制，找到作用的關鍵因子，對探討喉癌的治療策略具有重要意義。
氨基甲酰磷酸合成酶1（carbamyl phosphate synthase 1,CPS1）是一種參與尿素循環的線粒體酶。在肝臟中將氨轉化為氨基甲酰磷酸鹽[8]。在人類中，由遺傳缺陷引起的CPS1缺乏通常伴隨著氨水平升高，導致食欲減退，嗜睡，中樞神經系統功能障礙，腦損傷，昏迷，甚至死亡[9]。因為肝臟被認為是負責尿素合成的唯一器官，因此認為CPS1僅存在于正常肝細胞中并且在肝細胞癌發展過程中被下調[10]。然而有研究表明CPS1在胃癌、子宮頸癌和結直腸癌、乳腺癌等人類惡性腫瘤中被過度表達[11,12,13,14]。而且CPS1在肺腺癌中的高表達與患者預后差有關[15]。雖然CPS1在多種惡性腫瘤組織中的表達已經被研究過，但CPS1在喉癌中的表達鮮見報道，本研究通過觀察CPS1在喉鱗癌組織及癌旁組織中的表達，試圖探討其對喉癌發生發展的作用及臨床意義。
1、 資料與方法：
1.1 、一般資料
收集濱州醫學院附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科2016年3月至2019年5月原發喉癌手術切除標本72例，同時在距腫瘤邊緣≥5 mm處取癌旁組織，其中男49例，女23例；45~76歲，平均61歲；聲門型37例，非聲門型35例。高分化38例，中低分化34例，TNM分期，I-II期40例，III-IV期32例，有淋巴結轉移27例，無淋巴結轉移45例。喉癌組織標本經病理證實為鱗狀細胞癌，癌旁組織均為炎癥或正常黏膜，全部患者術前均未行放療、化療。所有手術中取材的新鮮標本一部分立刻存放于-80℃冰箱用于RT-PCR和Western blot檢測，一部分經10% 甲醛溶液固定，用于免疫組織化學法測定。所有患者均簽署知情同意書，研究方案經濱州醫學院倫理委員會（山東濱州）批準。標本存檔于濱州醫學院附屬醫院病理科，并保存所有患者臨床病理資料。
1.2 、檢測方法
1.2.1 、RT-qPCR檢測CPS1 mRNA
采用TRIzol試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取總mRNA。將總mRNA反轉錄為cDNA后進行實時PCR反應。所有引物均由上海生工（Sangon Biotech Co.Ltd）合成，本研究使用的RT-qPCR引物為：CPS1 正向，5'-TCA CAG AGG TCA TCA AGG CAG AA-3'和反向，5'-TCCGTAGCCATAATGGACTCAAC-3'，GAPDH正向，5'-CTG ACT TCA ACA GCG ACA CCC AC-3'和反向，5' -GCC AAA TTC GTT GTC ATA CCA GGA-3'。使用ABI 7300序列檢測系統在96孔板上分析樣品。1μL cDNA，2μL 10mmol/L引物和7μL ddH2O進行PCR熱循環，條件如下：95℃一個循環30s；然后進入40個循環：95℃ 5s，55℃ 30s和72℃ 20s。通過2-△△Ct法（Livak and Schmittgen,2001）分析目標基因mRNA轉錄物與GAPDH對照的相對水平。
1.2.2、 Western blot檢測CPS1蛋白表達
-80℃冰箱取出組織，放入RIPA裂解緩沖液（200ul RIPA,1mM PMSF,1mM Cooktail）中裂解。然后離心取上清，采用BCA定量法測定蛋白濃度。用SDS-PAGE電泳分離蛋白質樣品（30μg），然后將其轉移到PVDF膜上。5％脫脂奶粉封閉3小時，一抗孵育CPS1 (1:1000, abcam,ab45956)和GAPDH（1:5000,proteintech,no.10494-1-AP）4℃過夜。用1xTBST洗滌后，二抗（抗兔,1:5000,GOOD HERE）孵育2小時。使用ChemiDocTM MPImaging System使蛋白質條帶可視化。
1.2.3、 免疫組織化學法進一步驗證CPS1蛋白部位及表達水平
標本經10％甲醛固定，石蠟包埋，連續切成4μm厚切片，烘烤，常規脫蠟，水合。4%多聚甲醛固定10min，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）沖洗5min×3次，然后浸入0.1％Triton X-100中10min，在微波爐中用0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液加熱15 min完成抗原修復。冷卻至室溫后，封閉在5%山羊血清中10min后，再加入適量的內源性過氧化物酶阻斷劑并孵育10min。滴加一抗CPS1(1:1000,abcam,ab45956)在37℃下孵育1小時。PBS沖洗后，加入酶標記的山羊抗小鼠/兔IgG聚合物（PV-6000,ZSGB-BIO）作為二抗并孵育20min，將新制備的DAB（ZLI-9018,ZSGB-BIO）著色溶液置于玻片中持續6min。自來水充分沖洗后，蘇木精復染，然后脫水，透明，干燥并封片。最后，所有的圖像均用光學顯微鏡拍攝。
1.2.4 、免疫組化評分
根據免疫組化評分(immunohistochemical scores，IHS)的方法進行喉鱗癌患者CPS1表達水平與臨床病理參數之間的關聯性分析，結合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面進行評分，具體如下：按陽性細胞百分比計分:10個隨機100倍鏡下視野陽性細胞平均百分數分: 0分, 0%~5%；1分, >5%~15%；2分>15%~30%; 3分，>30%~75%；4分，>75%~100%陽性腫瘤細胞。根據得分獲得強弱對比陰性（–，0~1）；弱陽性（+，2~3），強陽性（++，4），弱陽性視為陽性表達。
1.3 、統計學處理
使用SPSS25.0進行分析，計量資料以`x±s 表示，計數資料采用%表示。兩組計量資料比較，服從正態分布的采用t檢驗，不服從正態分布的采用秩和檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。檢驗水準α= 0.05。
2 、結 果
2.1 、CPS1 mRNA在喉鱗癌組織及癌旁組織中的表達
以GAPDH mRNA為標準，采用RT-qPCR方法檢測喉鱗癌組織和癌旁組織中CPS1mRNA的表達。隨機選取30對樣本，其喉鱗癌組織平均 mRNA水平為 3.08±0.14，其癌旁組平均水平為2.53±0.13，喉鱗癌組織相對于癌旁組織CPS1mRNA水平明顯升高，差異有統計學意義（t=2.95;P=0.005）。
2.2 、CPS1蛋白在喉鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達
CPS1蛋白在喉鱗癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織。選用上述10對組織標本，用Western blot技術檢測CPS1蛋白的表達。結果顯示喉鱗癌組織中CPS1蛋白表達(0.69±0.10)水平高于癌旁組織(0.27±0.06)，差異有統計學意義（t=3.71;P=0.002）（圖1）,該結果與上述RT-qPCR結果一致。
圖1. CPS1蛋白在喉鱗癌組織和癌旁組織中的表達（LC：喉鱗癌組織；AT：癌旁組織）
Figure 1. Expression of CPS1 protein in laryngeal squamous cell carcinoma tissues and adjacent tissues(LC:laryngeal squamous cell carcinoma tissue;AT: Adjacent tissue)
2.3、 喉鱗癌組織中CPS1蛋白的表達與患者臨床病理參數的關系
我們使用免疫組織化學法來評估喉鱗癌組織及癌旁組織中CPS1的表達水平，癌旁組織和喉鱗癌組織HE染色（圖2A、圖2B），免疫組化顯示CPS1著色主要定位于細胞質或細胞膜（圖2C、圖2D）。72例LSCC組織中有54例呈陽性表達，陽性表達率75%（54/72），癌旁組織中CPS1陽性表達率為27%（20/72）。差異有統計學意義（P<0.01），CPS1蛋白表達與LSCC的臨床分期、分化程度及淋巴結轉移相關（P均<0.05），而與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史及腫瘤部位無關（P均>0.05）（見表1）。
圖2. HE染色和免疫組化
Figure 2. HE staining and immunohistochemistry
A：癌旁組織HE染色，B：喉鱗癌組織HE染色，C：癌旁組織免疫組化CPS1染色，D：喉鱗癌組織免疫組化CPS1染色；（放大倍數A-D，×400）A: HE staining of adjacent tissues; B: HE staining of laryngeal squamous cell carcinoma; C: immunohistochemical CPS1 staining of adjacent tissues; D: immunohistochemical CPS1 staining of laryngeal squamous cell carcinoma;(magnification factor A-D, × 400)
表1 喉鱗癌組織中CPS1蛋白陽性表達與患者臨床病理參數的關系
3 、討 論
CPS1作為多結構域的線粒體和腸道酶蛋白，參與許多癌癥的發生及發展，包括肝細胞癌、非小細胞肺癌、胃癌和惡性膠質瘤等[11,14,16,17]。本研究結果顯示，與癌旁組織相比，CPS1 mRNA和蛋白在喉鱗癌組織中表達升高，提示CPS1基因的高表達可能促進了喉癌的發生，這與Jun Li等在肝癌中研究的CPS1高表達相一致[16]。但是Kinoshita和Miyata等研究表明CPS1在肝癌組織中低表達，而且大量研究表明CPS1表達水平在許多類型的人類癌癥組織中有所不同，所以其臨床意義仍有待研究[18,19]，同時要求我們加大樣本量進一步確實我們的研究成果。
CPS1可促進腫瘤的增殖、侵襲，這與我們發現CPS1蛋白在喉鱗癌組織中表達與臨床分期和病理分化程度相關（χ2=7.500，P<0.05；χ2=6.019，P<0.05），且隨著臨床分期的增高和病理分化程度的降低表達增高結果一致，提示CPS1的表達可能參與喉癌的進展[14,17]。本研究提示在有淋巴結轉移的喉鱗癌患者中CPS1的表達比無淋巴結轉移的喉鱗癌患者表達更高（χ2=7.131，P<0.05），而與患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史及腫瘤部位無關。這與CPS1在直腸癌患者中的研究一致[20]。他們應用Western blot及免疫組織化學方法檢測直腸癌患者結腸鏡檢標本中CPS1的表達水平，結果表明CPS1過表達與晚期腫瘤和淋巴結狀態及腫瘤退行性分級顯著相關，考慮CPS1與喉癌的惡性程度有關。但是，我們的樣本量相對較少，無法對性別、類型、分期、分化程度、以及有無淋巴結轉移等重要因素之間的交互作用進行探討，之后我們會加大樣本量，以提高樣本的代表性，并進一步證實我們的研究結果，并對重要因素之間的交互作用進行分析探討，以期望其可以作為臨床干預決策的依據。
目前腫瘤的治療仍是當今難題，分子靶向治療為其提供好的研究方向，其研究喉癌分子機制找尋關鍵因子的可行性已被實踐證明。但CPS1是通過什么機制來參與喉癌的進展，仍需深入探討。研究表明CPS1的激活可能影響化療誘導的DNA損傷過程，通過NF-κB途徑調節腫瘤的生長發育[21]。另外抑癌基因p53可通過下調CPS1抑制腫瘤的發生，而p53又是NF-κB途徑調控腫瘤發生發展的關鍵因子，有理由認為CPS1可能通過NF-κB途徑調控頭頸腫瘤的發生[22]。但也有研究表明CPS1可由sirtuin蛋白5 (SIRT5)的轉錄激活或者去乙�；閷Ъせ�，SIRT5可促進多種腫瘤生長，與腫瘤的增值、侵襲相關，所以我們認為CPS1也可能通過SIRT5及其相關途徑參與喉鱗癌的發生[23,24]。另有研究表明一氧化氮會導致DNA損傷，導致腫瘤的發生，而CPS 1是一種參與尿素循環的線粒體酶。尿素循環功能變化導致精氨酸供應的變化影響一氧化氮的產生[25]。所以CPS1也可能參與代謝途徑調控喉鱗癌發生。
綜上所述，CPS1可能參與了喉癌的發生與發展，并探討了可能相關的分子機制，為今后喉癌的分子靶向治療的臨床應用提供理論前提。但其具體機制還有待于在今后的實驗中進一步證實。
參考文獻
[1] Zhu L, Qin G, Ye L, et al. Epithelial cell transforming sequence 2 expression is associated with the progression of laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Oncol Lett, 2019, 17(6): 5699-5704. doi:10.3892/ol.2019.10226.
[2] 鄒良玉, 李連賀, 岳文慧, 等. MIF、GSK-3β在喉鱗狀細胞癌中表達的臨床意義及相關性研究[J]. 山東大學耳鼻喉眼學報, 2019, 33(2): 76-80. doi:10.6040/j.issn.1673-3770.0.2018.423. ZOU Liangyu, LI Lianhe, YUE Wenhui, et al. Clinical significance and correlation between MIF and GSK-3βexpression in laryngeal squamous cell carcinoma[J]. Journal of Otolaryngology and Ophthalmology of Shandong University, 2019, 33(2): 76-80. doi:10.6040/j.issn.1673-3770.0.2018.423.
[3] 許莉, 王志頤, 陳偉, 等. MicroRNA-24對人喉鱗癌細胞生物學行為的影響[J]. 山東大學耳鼻喉眼學報, 2018, 32(6): 30-37. doi:10.6040/j.issn.1673-3770.0.2018.021. XU Li, WANG Zhiyi, CHEN Wei, et al. Effect of MicroRNA-24 on the proliferation, migration, invasion, and apoptosis of LSCC cells[J]. Journal of Otolaryngology and Ophthalmology of Shandong University, 2018, 32(6): 30-37. doi:10.6040/j.issn.1673-3770.0.2018.021.
[4] Markou K, Christoforidou A, Karasmanis I, et al. Laryngeal cancer: epidemiological data from Νorthern Greece and review of the literature[J]. Hippokratia, 2013, 17(4): 313-318.
[5] Yan ZY, Liu G, Liang M, et al. Ophiopogonin D inhibits cell proliferation and induces apoptosis of human laryngocarcinoma through downregulation of cyclin B1 and MMP-9 and upregulation of p38-MAPK signaling[J]. Oncol Lett, 2019, 17(2): 1877-1882. doi:10.3892/ol.2018.9788.
[6] Zhang B, Fu T, Zhang L. MicroRNA-153 suppresses human laryngeal squamous cell carcinoma migration and invasion by targeting the SNAI1 gene[J]. Oncol Lett, 2018, 16(4): 5075-5083. doi:10.3892/ol.2018.9302.
[7] Zhuang S, Liu F, Wu P. Upregulation of long noncoding RNA TUG1 contributes to the development of laryngocarcinoma by targeting miR-145-5p/ROCK1 axis[J]. J Cell Biochem, 2019, 120(8): 13392-13402. doi:10.1002/jcb.28614.
[8] Butler SL, Dong H, Cardona D, et al. The antigen for Hep Par 1 antibody is the urea cycle enzyme carbamoyl phosphate synthetase 1[J]. Lab Invest, 2008, 88(1): 78-88.doi:10.1038/labinvest.3700699.
[9] Diez-Fernandez C, Martínez AI, Pekkala S, et al. Molecular characterization of carbamoyl-phosphate synthetase (CPS1) deficiency using human recombinant CPS1 as a key tool[J].Hum Mutat, 2013, 34(8): 1149-1159. doi:10.1002/humu.22349.
[10] Yang C, Fu R, Zhuang ZH, et al. Studies on the biological functions of CPS1 in AFB1 induced hepatocarcinogenesis[J]. Gene, 2016, 591(1): 255-261. doi:10.1016/j.gene.2016.07.031.
[11] Chu PG, Weiss LM. Immunohistochemical characterization of signet-ring cell carcinomas of the stomach, breast, and colon[J]. Am J Clin Pathol, 2004, 121(6): 884-892.doi:10.1309/A09E-RYMF-R64N-ERDW.
[12] Thamboo TP, Wee A. Hep Par 1 expression in carcinoma of the cervix: implications for diagnosis and prognosis[J]. J Clin Pathol, 2004, 57(1): 48-53. doi:10.1136/jcp.57.1.48.
[13] Palaniappan A, Ramar K, Ramalingam S. Computational identification of novel stage-specific biomarkers in colorectal cancer progression[J]. PLoS One, 2016, 11(5): e0156665.doi:10.1371/journal.pone.0156665.
[14] Daniel P, Halada P, Jelínek M, et al. Differentially expressed mitochondrial proteins in human MCF7 breast cancer cells resistant to paclitaxel[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(12): E2986. doi:10.3390/ijms20122986.
[15] ?eliktas M, Tanaka I, Tripathi SC, et al. Role of CPS1 in cell growth, metabolism and prognosis in LKB1-inactivated lung adenocarcinoma[J]. J Natl Cancer Inst, 2017, 109(3): 1-9.doi:10.1093/jnci/djw231.
[16] Li J, Chen L, Zhang XF, et al. Detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma using antibodies against asialoglycoprotein receptor, carbamoyl phosphate synthetase 1 and Pan-cytokeratin[J]. PLoS One, 2014, 9(4): e96185. doi:10.1371/journal.pone.0096185.
[17] Milinkovic V, Bankovic J, Rakic M, et al. Identification of novel genetic alterations in samples of malignant glioma patients[J]. PLoS One, 2013, 8(12): e82108.doi:10.1371/journal.pone.0082108.
[18] Kinoshita M, Miyata M. Underexpression of mRNA in human hepatocellular carcinoma focusing on eight loci[J]. Hepatology, 2002, 36(2): 433-438. doi:10.1053/jhep.2002.34851.
[19] Liu HY, Dong HJ, Robertson K, et al. DNA methylation suppresses expression of the urea cycle enzyme carbamoyl phosphate synthetase 1 (CPS1) in human hepatocellular carcinoma[J]. Am J Pathol, 2011, 178(2): 652-661. doi:10.1016/j.ajpath.2010.10.023.
[20] Lee YY, Li CF, Lin CY, et al. Overexpression of CPS1 is an independent negative prognosticator in rectal cancers receiving concurrent chemoradiotherapy[J]. Tumour Biol, 2014, 35(11): 11097-11105. doi:10.1007/s13277-014-2425-8.
[21] Liu X, Zhang XT, Bi JB, et al. Caspase recruitment domain family member 10 regulates carbamoyl phosphate synthase 1 and promotes cancer growth in bladder cancer cells[J]. J Cell Mol Med, 2019, 23(12): 8128-8138. doi:10.1111/jcmm.14683.
[22] Li L, Mao YX, Zhao LN, et al. p53 regulation of ammonia metabolism through urea cycle controls polyamine biosynthesis[J]. Nature, 2019, 567(7747): 253-256. doi:10.1038/s41586-019-0996-7.
[23] 劉義文, 廖春嬌, 黃順東. 肝癌組織中SIRT5的表達及其臨床病理意義[J]. 中國醫學創新, 2019, 16(4): 136-139. doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2019.04.035. LIU Yiwen, LIAO Chunjiao, HUANG Shundong. The expressions and clinicopathological significance of SIRT5 in hepatocellular carcinoma[J]. Medical Innovation of China, 2019, 16(4): 136-139. doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2019.04.035.
[24] 李佳峰, 孫宇哲, 李慶昌. Sirtuin 4和Sirtuin 5蛋白在代謝性疾病與腫瘤中的研究進展[J]. 現代腫瘤醫學, 2018, 26(21): 3516-3519. doi:10.3969/j.issn.1672-4992.2018.21.043.
[25] Cardona DM, Zhang XK, Liu C. Loss of carbamoyl phosphate synthetase I in small-intestinal adenocarcinoma[J]. Am J Clin Pathol, 2009, 132(6): 877-882.doi:10.1309/ajcp74xgrfwtflju
