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EPO藥物糖基化與活性的關系及糖基化分析方法

時間:2018-04-09作者:羽沫
本文導讀:這是一篇關于EPO藥物糖基化與活性的關系及糖基化分析方法的文章,近年來, 由于高分辨質譜技術的快速發展, 對EPO糖肽和糖鏈的分析方法日益成熟。因此, 新的糖基化分析方法將成為藥典方法的重要補充以及今后藥物質量控制和結構與生物活性關系研究的有效手段。

  論文題目:EPO藥物糖基化與活性的關系及糖基化分析方法
 

  摘要:重組人促紅細胞生成素 (recombinant human erythropoietin, r Hu EPO) 是糖蛋白類藥物, 臨床上主要用于治療腎性貧血。糖基化是影響促紅細胞生成素 (erythropoietin, EPO) 藥物質量、安全性和活性的關鍵因素。近年來, EPO藥物的原始專利即將過期, 生物仿制藥 (biosimilar) 進入一個高速發展期。因此, 亟需發展可有效評價其糖基化修飾形態的方法。本文對EPO藥物的發展、糖基化與活性的關系及糖基化分析方法的最新研究進展作一綜述。

  關鍵詞:促紅細胞生成素; 糖基化;

  促紅細胞生成素 (erythropoietin, EPO) 是一種高度唾液酸化的糖蛋白類激素, 造血細胞因子超家族成員之一[1]。人體中的EPO絕大部分由腎臟產生, 主要功能是促進紅細胞的生成, 提高機體血紅蛋白的濃度。EPO通過結合其受體 (erythropoietin receptor, EPOR) 而發揮作用, 誘導受體構象的改變, 從而激活下游的磷酸化信號通路[2]。1988年出現了與天然EPO活性幾乎相同的重組EPO (recombinant human erythropoietin, r Hu EPO) 產品, 迅速成為一種應用廣泛的生物工程類藥物[3]。臨床上主要用于治療各種疾病引發的貧血, 包括慢性腎衰竭、癌癥及AIDS等。r Hu EPO能明顯改善機體攜氧能力, 增強人的耐力, 減少機體的運動性疲勞。因此, EPO也是一種激素類興奮劑, 被濫用于一些耐力性比賽中。

  1989年, Amgen公司研制的epoetin alfa (Epogen) 是第一個進入市場的EPO制品。1997年, 羅氏公司的epoetin beta (Neo Recormon) 被歐洲藥品管理局 (EMA) 批準上市。這兩者均是通過人促紅細胞生成素基因轉染中國倉鼠卵巢細胞 (CHO) 表達獲得[4]。隨后, 第1代EPO包括epoetin delta、epoetin omega及epoetin theta被研制成功, 其內源性的EPO具有相同的氨基酸序列, 但不同制品間存在糖基化差異。第1代EPO半衰期相對較短, 需要每周給藥1~3次, 給患者帶來不便。2001年, Amgen公司研制的長效EPO制劑新紅細胞生成刺激蛋白 (novel erythropoiesis stimulating protein, NESP) , 又稱為darbepoetin alfa, 商品名為Aranesp的NESP已被FDA和EMA批準上市[5]。NESP是r Hu EPO高度糖基化的類似物, 通過氨基酸的定點突變, 在30和88位額外增加了2個N-糖基化位點。與epoetin alfa相比, NESP對EPOR的親和力降低, 使其在體內的半衰期延長3~4倍。2007年, 羅氏公司的持續性促紅細胞生成素受體激活劑 (continuous erythropoietin receptor activator, CERA) 被EMA批準上市[6]。CERA是在epoetin beta分子的氨基酸位置Ala1、Lys45者Lys52上連接甲氧基聚乙二醇獲得, 是一種聚乙二醇修飾的r Hu EPO。相對分子質量約60 000, 體內半衰期長達130~140 h。NESP和CERA被稱為第二代EPO, 具有更長的半衰期和更高的生物活性。

  近年來, 第一代原研EPO藥物專利到期, 生物仿制藥 (biosimilars) 的研發快速發展[7]。目前, 在歐洲和日本分別有2個和1個EPO生物仿制藥被批準上市。隨著第二代EPO藥物專利保護即將到期, EPO生物仿制藥市場將進入一個新局面。然而與小分子藥物不同, 蛋白類藥物不僅相對分子質量較大, 結構復雜, 且存在蛋白翻譯后修飾, 如糖基化的存在, 使其結構高度不均一。同時對于仿制藥研發和質量控制中, 證明其與原研藥的一致性或相似性是關鍵問題, 需開發合理的分析方法。

  1 EPO糖基化修飾形態與生物活性的關系

  內源性EPO是由165個氨基酸組成的多肽, 同時含有3個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點[8]。糖鏈約占總分子量的40%, 對其體內的生物活性有較大影響。最重要的糖基化影響因素是EPO唾液酸的含量, 未發生唾液酸修飾的糖鏈, 末端裸露的半乳糖會被肝臟半乳糖受體識別, 從而快速被清除。進一步研究表明, 唾液酸如果發生了O-乙;揎, 其保護作用也會增強。因此, 對于EPO生產商而言, 需要最大程度地保證蛋白唾液酸化和乙;揎。第1代EPO, 每個分子最多可能含有14個唾液酸和28個O-乙;, 而第2代NESP由于含有5個N-糖基化位點和1個O-糖基化位點, 最多可能含有22個唾液酸和44個O-乙;, 使NESP在體內的半衰期大大延長[5]。EPO中糖鏈的天線類型是影響其活性的另一個重要因素。研究表明, 低天線結構的糖鏈與高天線結構的糖鏈相比, 體內生物活性更低[9]。連接有N-乙酰半乳糖胺 (Lac NAc) 的糖鏈也會進一步降低EPO的體內活性, 這主要是由于其空間位阻降低, 易被半乳糖受體識別而被從血液中清除。

  除了考慮糖基化修飾對EPO生物活性的影響, 藥物的安全性和潛在的副作用也是質量控制的關鍵。在哺乳動物中, 最常見的唾液酸是N-乙酰神經氨酸 (N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac) 和N-羥乙酰神經氨酸 (N-glycolylneuraminic acid, Neu5Gc) 。而人體中不能合成Neu5Gc, 同時含有抗Neu5Gc的抗體[10]。而來源于CHO細胞系的EPO, 往往同時含有這兩種唾液酸形式。因此, 需要對EPO中唾液酸的類型和含量進行詳細分析, 保證具有較低含量的Neu5Gc。同時, 也需要分析EPO中是否存在一些不完整或不正確的糖鏈。例如, 在商品化的EPO制劑中, 磷酸化的高甘露糖的糖鏈是一種常見的副產物。目前, 對于這種高甘露糖鏈對EPO的藥代動力學的影響尚未有研究報道。

  2 EPO糖基化修飾形態的分析方法

  2.1 完整蛋白的分析

  等電聚焦法 (isoelectric focusing, IEF) 是常見的一種蛋白質分析方法, 基于所帶電荷不同實現分離。由于EPO中帶負電荷的唾液酸對其生物活性有重要影響, IEF已被廣泛應用于EPO異構體的分離中, 特別是興奮劑檢測中[11]。二維電泳 (2-DE) 是一種同時基于電荷和分子量的蛋白分離方法, 也被應用于EPO異構體的分離中。毛細管電泳 (capillary electrophoresis, CE) 的方法是最初研究最多的。Sanz-Nebot課題組利用腐胺 (1, 4-丁二胺) 動態涂成實現了EPO幾種糖基化異構體的基線分離。但這種方法平衡時間長, 重復性差, 且緩沖體系中的非揮發性物質無法與質譜聯用[12]。TAICHRIB等[13]利用商品化的毛細管電泳-質譜聯用技術結合飛行時間質譜強大的質荷比分辨能力, 檢測到更低含量的EPO異構體。采用線性聚酰胺的毛細管中性涂成柱, 實現了唾液酸分離的基礎上, 不同Hex Hex NAc二糖單元的有效分離。

  液相色譜 (liquid chromatography, LC) 是一種與CE相當的常見分離手段, 近年來發展非常迅速。HARAZONO等[14]首次報道了利用反向C18固定相結合ESI-MS用于完整EPO蛋白的分析。對質譜數據去卷積處理后, 蛋白相對分子質量范圍為28 000~32 000, 糖鏈的組成為Neu Ac10-14Hexn+3Hex NAcnFuc3 (n=16~26) 。作者還發現了糖鏈的O-乙;揎、唾液酸二糖Neu Gc-Neu Ac及可能存在蛋白的氧化形式。對去N-糖基化的EPO進行分析, 可鑒定O-糖鏈的結構為Neu Ac1-2Hex1Hex NAc1及O-糖基化位點。同時, 對Darbepoetin的分析表明, 其糖鏈的唾液化和乙;潭染^高。證明LC/ESI-MS是一種用于評價不同EPO產品糖型相似性的有效手段, 同時得到唾液酸化程度、糖鏈大小、唾液酸的乙;癘-糖基化的信息。與CE相比, 反向色譜對糖蛋白分離效果較差, 然而獲得豐富糖鏈的結構信息, 主要是LC與質譜兼容性更好。

  2.2 糖肽的分析

  完整EPO蛋白的分析, 具有樣品消耗量少、前處理簡單 (不需化學或酶解處理) 等優點。然而, 獲得的整個蛋白的糖基化信息, 無法確定每個糖基化位點的修飾程度。同時, 完整蛋白質譜分析對儀器性能的要求較高。因此, 可經酶切后, 對分離的糖肽進行分析。理性的狀態是每個糖肽中僅有1個糖基化位點, 就可實現位點特異性的糖基化分析。蛋白酶的選擇對特異性糖基化分析十分重要, 蛋白組學中常用的是胰蛋白酶 (trypsin) , 可特異性酶切精氨酸 (R) 和賴氨酸 (K) 的C′-末端。在EPO分析中, 由于糖基化位點N24和N38無trypsin酶切位點, 獲得的糖肽含有兩個糖基化位點, 無法進行位點特異性的糖基化分析。然而, Glu-C特異性酶切谷氨酰胺 (E) 和天冬酰胺 (D) 的C′-末端。Glu-C可有效酶切EPO, 獲得的4條糖肽中分別僅含有1個糖基化位點。

  TAKEGAWA等[15]報道了毛細管兩性離子親水相互作用色譜-質譜聯用技術對Glu-C酶解后的r Hu EPO的肽段進行分析, 僅需150 ng樣品, 單次分析就可鑒定105種N-糖肽和8種O-糖肽。同時, 發現部分N-糖鏈和O-糖鏈發生了乙;揎椉按嬖谕僖核嵝问絅eu5Gc。作者還考察N-糖肽的色譜保留機制, 與N-糖鏈的組成密切相關。

  JIANG等[16]采用Glu-C/trypsin混合酶切, HILIC富集糖肽及結合Orbitrap結構鑒定, 實現了EPO中N-糖肽和O-糖肽的定性和定量分析, 在糖肽的結構鑒定中, 如何通過二級質譜數據識別糖肽母離子十分重要, 研究者通過Y1 (peptide+Glc NAc) 和Y0 (peptide) 離子, 結合常見的糖診斷離子 (單糖、二糖或三糖氧鎓離子及其碎片離子) ;確定糖肽母離子后, 通過高能碰撞解離 (high-energy collisional dissociation, HCD) 碎裂產生的B/Y離子結合GlycoMod計算, 確定糖鏈的組成;最終鑒定了74條完整的糖肽異構體, 同時結合提取離子流色譜圖 (extracted ion chromatograms, XIC) 分析實現糖肽的相對定量分析。

  對于darbepoetin alfa的糖肽分析相對比較復雜, 目前尚無一種酶可酶切Asn24與Asn30及Asn83與Asn88之間的肽鍵。因此, 傳統的特異性酶切手段無法實現darbepoetin alfa位點特異性的糖肽分析。STRUM等[17]和HUA等[18]提出“glyco-AMP”策略, 已成功應用于一系列糖蛋白的位點特異性的N-糖基化和O-糖基化分析, 這種策略利用多個酶切位點的蛋白酶混合物, 通過控制反應時間得到不同程度的酶切產物。因此, “glyco-AMP”策略將有機會用于darbepoetin alfa的糖肽分析。

  2.3 糖鏈的分析

  與完整的蛋白或糖肽分析相比, 糖鏈的分析方法更靈敏。較小的糖鏈分子更容易分離、質譜離子化或檢測也更容易, 可檢測到更低豐度的糖型。同時結合串聯質譜碎裂或糖苷外切酶酶解的數據, 可實現完整結構的鑒定, 是目前糖基化分析的最重要方法之一[19]。盡管EPO中同時存在N-糖鏈和O-糖鏈, 但對EPO糖鏈的分析主要集中于N-糖鏈, 這是由于傳統用于O-糖鏈釋放的方法如堿性β-消除, 條件比較苛刻, 唾液酸易丟失或O-乙;揎椧妆黄茐腫20]。而對N-糖鏈的分析相對簡單, PNGase F酶切就可得到EPO中所有的N-糖鏈, 再對糖鏈進行熒光衍生, 常見的衍生試劑2-氨基苯酰胺 (2-AB) 及4-氨基苯甲酸 (4-AA) 已用于EPO糖鏈的分析[21]。如以MS檢測, 衍生不是必須的, 也可直接分析。這樣可有效避免衍生過程中產生的化學降解、大量衍生試劑的干擾及額外樣品前處理帶來的重復性差等問題。

  然而, EPO中的糖鏈十分復雜, 液相色譜分離在質譜鑒定前是必須的。這不僅可擴大質譜檢測的動態范圍, 也可減少質譜分析中的離子抑制。目前已有3種類型的色譜形式用于EPO糖鏈的分離, 包括陰離子交換色譜 (anion exchange chromatography, AEC) 、親水相互作用色譜 (hydrophilic interaction chromatography, HILIC) 及多孔石墨化碳柱 (porous graphitized carbon column, PGC) 。AEC主要是基于大部分EPO糖鏈末端唾液酸所帶的負電荷實現糖鏈的分離, 常與HILIC相結合組成二維色譜, 提高其對酸性糖鏈的分離能力[22-23]。PGC是一種混合模式的固定相, 通過電荷作用、偶極-偶極作用以及疏水作用實現分析物的高效分離, 已被廣泛應用于糖鏈異構體的分離中[24]。

  LLOP等[22]及BONES等[25]首次報道了將HILIC、MALDI-TOF-MS及外切酶測序結合用于對EPO和darbepoetin alfa中N-糖鏈的分析, 作者通過弱陰離子交換色譜 (weak anion exchange chromatography, WAX) 可獲得糖鏈唾液化的信息。結合與外切酶的特異性及酶切后產物的質譜分子量信息可鑒定HLIC色譜圖中每個峰對應糖鏈的結構, 在此基礎上, 作者實現了對二維電泳中每個蛋白點對應糖鏈結構分析。為進一步評價生物制品的免疫原性, 對其唾液酸類型及乙;潭冗M行了考察, 結果顯示, 與r Epoα/β相比, r Epoδ不含Neu5Gc, 不發生O-乙;揎。

  BONES等[25]利用離線二維分離平臺AEC x UPLC HILIC, 全面解析EPO中N-糖鏈的結構, 在此基礎上, 通過Lys-C和Glu-C雙酶切EPO后結合糖肽純化, 實現了3個N-糖基化位點特異性的糖型分布研究, 首次在Asn 24和Asn 83鑒定了含有最大數量的聚-N-乙酰乳糖胺二糖重復單元 (poly-N-acetyl lacto samine repeats, Lac NAc) 的糖型。OH等[26]采用納流色譜-芯片-串聯質譜技術 (chip-based nano-LC-MS&MS/MS) 在darbepoetin alfa中鑒定了多達400種N糖鏈的結構 (包括異構體) , 而該方法對儀器等實驗室條件要求較高, 且由于離子化效率的差異等因素可能會導致質譜定量的準確性較低。最近, HASHI等[27]又報道了將LC-MSn的糖鏈結構鑒定策略與多變量分析數理統計方法相結合, 用于9種r Hu EPO產品糖不均一性的比較, 實驗發現基于糖鏈含量的主成分分析數據是一種有效評價不同r Hu EPO產品的重要參考值。

  3 小結與展望

  近年來, 許多促紅細胞生成類藥物的原始專利即將過期, 這類藥物的生物仿制藥 (biosimilar) 即將進入一個高速發展期。生物仿制藥可能會采用一系列不同的培養系統和下游的純化工藝, 因此藥物控制和監管機構已經預測需要更新和開發額外的指導方針和測試用于新產品的審批。促紅細胞生成類藥物的糖基化修飾在不同的細胞系中不完全一致, 受細胞培養條件及下游工藝影響也較大, 因此, 糖基化修飾的分析并建立質量控制標準是此類藥物分析的一個主要研究方向。本文綜述了近年來對促紅細胞生成素糖基化分析方法的研究進展, 主要從蛋白水平、糖肽水平及糖鏈水平進行介紹。傳統方法比較不同批次的EPO是在完整糖蛋白水平上進行毛細管電泳和等電聚集分析。近年來, 由于高分辨質譜技術的快速發展, 對EPO糖肽和糖鏈的分析方法日益成熟。因此, 新的糖基化分析方法將成為藥典方法的重要補充以及今后藥物質量控制和結構與生物活性關系研究的有效手段。

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